eDNA als neues Werkzeug für das Gewässermonitoring – Potenzial und Rahmenbedingungen anhand ausgewählter Anwendungsbeispiele aus Österreich

Süßwassersysteme bieten ein breites Spektrum an Ökosystemdienstleistungen, wie beispielsweise die Bereitstellung von Trinkwasser, die Verwendung als Transportwege, für Hochwasserschutz und zur Energiegewinnung sowie auch als Lebensraum und für Erholungszwecke (Brauman et al. 2007). Die intensive Nutzung von Süßwassersystemen führte hierbei jedoch zu Lebensraumveränderungen sowie Belastungen dieser Ökosysteme (Dudgeon et al. 2006). Gleichzeitig beherbergen Süßwasserlebensräume und vor allem Fließgewässer jedoch eine ungleich hohe Biodiversität gemessen an ihrem flächenmäßigen Anteil an allen Ökosystem weltweit: Während Süßwassersysteme nur 0,8 % der weltweiten Erdoberfläche einnehmen (Gleick 1996), finden sich fast 6 % aller beschriebenen Tier- und Pflanzenarten in ihnen (Hawksworth und Kalin-Arroyo 1995; Gibert und Deharveng 2002). Diese extrem dichte Biodiversität, die starke Nutzung der Fließgewässer und die komplexen Einflussbereiche und -netzwerke, welche auf sie wirken, machen Flüsse global zu einer der am stärksten durch Biodiversitätsverlust gefährdeten Lebensräume (Dudgeon et al. 2006; WWF 2018; Díaz et al. 2019). Die Auswirkungen der Belastungen auf Süßwassersysteme und deren Lebensgemeinschaften können bereits weltweit beobachtet werden und ließen beispielsweise zwischen 1970 und 2012 die durchschnittliche Abundanz aller überwachten Tier- und Pflanzenpopulationen in Süßgewässern um 81 % sinken (WWF 2016). Um diesem Biodiversitätsverlust entgegenzuwirken und auch die nachhaltige Nutzung von Gewässersystemen zu gewährleisten, wurden weltweit legislative Werkzeuge ins Leben gerufen.

In diesem Kontext wurde auf europäischer Ebene im Jahr 2000 die Richtlinie 2000/60/EG erlassen, besser bekannt als Wasserrahmenrichtline (WRRL). Zentrale Elemente der Zielsetzungen der WRRL ist integratives Flussgebietsmanagement und eine laufende Überwachung des ökologischen Zustands der Oberflächengewässer (Muhar et al. 2011). Zur Erhebung des ökologischen Zustands eines Gewässers werden die Artzusammensetzung und Abundanz sogenannter biologischer Qualitätselemente erhoben und mit der erwarteten Artenliste unter Referenzbedingungen verglichen. Je weiter hierbei der Ist-Zustand vom Referenzzustand abweicht, desto schlechter fällt die Bewertung des ökologischen Zustands aus¹. Die Methoden zur Beprobung und Artbestimmung der biologischen Qualitätselemente wurden von den einzelnen Mitgliedstaaten entwickelt (z. B. BMLFUW 2015) und zwischenstaatlich zur Standardisierung interkalibriert (Birk und Böhmer 2007; Birk et al. 2013). Trotz Interkalibrierungen gibt es jedoch erhebliche Unterschiede bei Beprobungsaufwand, taxonomischer Auflösung und Metrikberechnungen zwischen den einzelnen Mitgliedstaaten (Birk et al. 2012). Was jedoch allen Methoden gemein ist, sind die morphologischen Methoden bei den taxonomischen Bestimmungsarbeiten zur Erhebung der biologischen Qualitätselemente. Diese erfordert naturgemäß das gezielte Aufsammeln von Individuen der Zielbioindikatorgruppe (mit Ausnahme der Makrophyten). Hierbei werden im Rahmen der Beprobung entweder Individuen der Zielbioindikatorgruppe komplett aus dem Gewässer entnommen und für die Analysen fixiert (z. B. Phyto- und Makrozoobenthos), oder zur Erhebung der Fischfauna, Elektrobefischungen herangezogen, wobei die Fische nach Art- und Größenbestimmung sowie Wägung wieder in das Gewässer entlassen werden. Jedoch kann Elektrofischen unter bestimmten Bedingungen mit erheblichem materiellen und personellen Aufwand verbunden sein und stößt z. B. bei sehr großen Fließgewässern oder Seen an seine Grenzen. Während bei Fischen die Artbestimmung aufgrund der überschaubaren Diversität verhältnismäßig schnell und im Feld erfolgen kann, kann dieser Arbeitsschritt bei komplexeren Bioindikatorgruppen wie Phytobenthos oder Makrozoobenthos je nach Erhebung durchaus mehrere Tage bis Wochen in Anspruch nehmen. Weiters wird hierfür fachlich spezialisiertes Personal benötigt, um die Bestimmungsarbeiten verlässlich durchführen zu können.

In den letzten 10 bis 15 Jahren wurde für Biodiversitätserhebungen DNA-basiertes Monitoring als wertvolle Ergänzung zu den etablierten, konventionellen Erhebungsmethoden vorgeschlagen (Baird and Hajibabaei 2012; Hering et al. 2018). Hierbei soll die konventionelle taxonomische Bestimmungsarbeit durch genetische Ansätze unterstützt und ergänzt werden. Das Konzept, welches hierfür verwendet wird, ist das sogenannte DNA-Barcoding. DNA-Barcoding bezeichnet die taxonomische Zuordnung eines Tier- oder Pflanzenexemplars basierend auf seiner DNA-Sequenz eines bestimmten genetischen Markers (Hebert et al. 2003). Hierfür wird die DNA aus einer Gewebeprobe des Exemplars extrahiert und der genetische Marker (im Falle von Tieren, das sogenannte Cytochrom-Oxidase-I-Gen, ein Teil des mitochondriellen Genoms) durch eine Polymerase-Kettenreaktion (oder „PCR“) vervielfältigt. Dieses amplifizierte DNA-Fragment wird danach sequenziert und die erhaltene DNA-Sequenz wird mit einer genetischen Referenzdatenbank abgeglichen (Abb. 1).

Die weltweite Initiative IBOL (International Barcode of Life) hat zum Ziel, solche genetische Referenzsequenzen dieser Marker für das gesamte multizelluläre Biodiversitätsspektrum unseres Planeten zu generieren, um so einerseits die genetische Diversität aller Spezies weltweit zu charakterisieren, aber auch um weltweit genetische Artidentifikationen basierend auf diesen genetischen Barcodes zu ermöglichen (IBOL 2019). Dieser Ansatz stellt bereits eine vielversprechende Ergänzung zu morphologischen Bestimmungsarbeiten dar (beispielsweise bei morphologisch kryptischen Arten). Allerdings liegt ein noch weitaus größeres Potenzial für den Einsatz von genetischen Methoden im Biomonitoring in der Kombination des Barcoding-Ansatzes mit der Verwendung von eDNA (aus dem Englischen von „environmental DNA“), auch bekannt als Umwelt-DNA.

Der Begriff eDNA beschreibt jegliche Art von Genmaterial, welches von Organismen an Ihre Umwelt abgegeben wurde und wiederum aus einer Umweltprobe gewonnen werden kann, ohne den ursprünglichen DNA-Spender zuerst identifizieren oder isolieren zu müssen (Taberlet et al. 2012). Diese Umwelt-DNA kann dabei unterschiedlichsten Ursprungs sein. Im Falle von vielzelligen tierischen Organismen in Gewässern entstammt sie dabei meist abgestoßenen Gewebezellen oder Zellteilen, die beispielsweise durch das Abstreifen von Haut‑, Schleim- oder Schuppenzellen oder durch Ausscheidungen wie Kot, Speichel, Blut oder Geschlechtsflüssigkeiten in das Wasser abgegeben wurden. Das Substrat, aus dem diese eDNA gewonnen werden kann, ist ebenso vielfältig wie der Ursprung der DNA und reicht von Wasser- über Bodenproben oder Sedimenten bis hin zu Luft oder dem Mageninhalt von Raubtieren oder blutsaugenden Insekten (Taberlet et al. 2012; Deiner et al. 2017; Ruppert et al. 2019). Im Falle von Fließgewässern wird eDNA meist durch das Filtrieren von Wasserproben gewonnen (Abb. 2a). Das Konzept der Isolation von DNA aus Umweltproben ist per se nicht neu und wurde bereits in den 1990ern verwendet, um z. B. bakterielle oder andere mikrobielle Gemeinschaften in diesen Substraten zu charakterisieren (Coissac et al. 2012; Thomsen and Willerslev 2015; Deiner et al. 2017). Da hierbei jedoch die gesamten Organismen, welche analysiert werden, entnommen werden, werden solche Proben manchmal nur als eDNA-Proben im weiteren Sinne oder als „Community DNA“-Proben (zu Deutsch: Gesellschafts-DNA) definiert (Deiner et al. 2017). Die erste Studie, welche erstmalig eDNA gewonnen aus Wasserproben verwendete, um eine makrobiotische Art nachzuweisen, wurde 2008 durchgeführt: Ficetola et al. (2008) verwendeten DNA gewonnen aus Teichwasser, um den invasiven Nordamerikanischen Ochsenfrosch (Rana catesbeiana) in Frankreichs Gewässern nachzuweisen. Hierfür wurde die Gesamt-DNA in den entnommenen Wasserproben extrahiert und mittels eines artspezifischen Protokolls zur Amplifikation eines Barcodes selektiv für diese Art isoliert. Hierbei zeigte sich vor allem die hohe Sensitivität dieses Ansatzes, wodurch sich auch bei sehr geringen Dichten des Ochsenfrosches ein positives Detektionssignal erhalten ließ, was vor allem für Erhebungen von invasiven, seltenen, bedrohten oder versteckt lebende Arten von entscheidendem Vorteil ist (Ficetola et al. 2008). Das Konzept solcher sogenannten „single-species“-Analysen (qPCRs; quantitative PCR, auch real-time PCR genannt), wurde danach für viele aquatische Organismen wie Fische (z. B. Carim et al. 2016; Roy et al. 2018), weitere Amphibien (Pilliod et al. 2013; Biggs et al. 2015) aber auch Wasserinsekten (Doi et al. 2017; Mauvisseau et al. 2019) und Krebstiere (Mächler et al. 2014; Robinson et al. 2018) angewendet. Im Gegensatz zum Metabarcoding (siehe unten) wird bei qPCR-Ansätzen die DNA in der eDNA-Probe nicht sequenziert. Auf die Anwesenheit der Ziel-DNA kann hierbei schon während der PCR-Reaktion, rein durch die Amplifikation (bzw. das Fehlen dieser) geschlossen werden (Abb. 2b). Dies ist bei der Untersuchung einzelner oder weniger Zielarten eine weitaus günstigere Alternative zum Metabarcoding und kann auch sensitiver bezüglich der Detektionswahrscheinlichkeiten sein (Harper et al. 2018; Bylemans et al. 2019). Während für die oben beschriebenen Ansätze die technischen Voraussetzungen bereits in den 1990ern vorhanden waren und der Schritt zur Anwendung dieser für Makroorganismen in z. B. Süßwassersystemen nur ein konzeptionelles Übertragen erforderte, war für die Idee, ganze Artengemeinschaften mittels eDNA zu charakterisieren, eine technologische Weiterentwicklung nötig. Diese erfolgte in den frühen 2000ern mit der Entstehung sogenannter „Next Generation Sequencing“ (NGS) oder „High Throughput Sequencing“ (HTS)-Methoden. NGS oder HTS beschreiben hierbei mehrere unterschiedliche Sequenziermethoden, welche von Firmen wie Thermo Fisher Scientific, Roche oder Illumina entwickelt wurden, um das rasche und parallele Sequenzieren von tausenden DNA-Molekülen in sehr kurzer Zeit zu ermöglichen. Dies ermöglichte einerseits die kosteneffiziente Entschlüsselung gesamter Genome einzelner Arten oder Individuen, ermöglichte aber auch den eDNA-Ansätzen das Konzept des „Metabarcodings“: Hierbei wird nun nicht gezielt der genetische Marker einer einzelnen Art aus der eDNA-Probe amplifiziert, sondern es werden mithilfe sogenannter „universeller Primer“ die Barcodes aller Vertreter einer ausgewählten Ziel-Artengruppe (z. B. Kieselalgen, Wasserinsekten, Knochenfische) generiert, sofern sich von ihnen DNA in der eDNA-Probe befindet. Durch Abgleich dieser parallel generierten Barcodes mit einer genetischen Referenzdatenbank lässt sich dann ein Gesamtbild der vorhandenen Arten dieser Zielgruppe in der Umgebung der Probe generieren (Abb. 2c).

Der Einsatz von eDNA-Methoden (sowohl Metabarcoding als auch Einzelartansätze) bietet viele Möglichkeiten, derzeitige Gewässermonitoring-Methoden zu unterstützen und zu ergänzen. Er kann eindeutige Ergebnisse liefern, wo konventionelle Methoden an ihre Grenzen stoßen und weist einen hohen Kosten-Nutzen-Faktor auf. Vor allem in Bezug auf invasive, seltene, bedrohte oder versteckt lebende Arten können die hochsensitiven eDNA-Ansätze wertvolle Beiträge für Monitoringarbeiten liefern. Allerdings bedarf es bei der Interpretation von eDNA-Analysen eines klaren Verständnisses der Rahmenbedingungen, sowohl habitatbezogen als auch methodeninherent. Die Grundlagenforschung mit und an eDNA-Ansätzen schreitet rasant voran und lässt weitere spannende Entwicklungen dieser Methoden sowie darauf basierender Ergebnisse für das Gewässermanagement erwarten.