Moderne optische Spektroskopie

Ihre außergewöhnliche Empfindlichkeit und Geschwindigkeit machen optische spektroskopische Techniken gut geeignet, um eine breite Palette von Fragen in der molekularen und zellulären Biophysik zu beantworten. Photomultiplier, die empfindlich genug sind, um ein einzelnes Photon zu detektieren, ermöglichen es, die Fluoreszenz von einzelnen Molekülen zu messen, und Laser, die Lichtpulse mit Breiten von weniger als 10^–14 s liefern, können zur Untersuchung des molekularen Verhaltens im Zeitbereich von Kernbewegungen verwendet werden. Spektroskopische Eigenschaften wie Absorption, Fluoreszenz, Streuung und linearer und zirkularer Dichroismus können über die Identitäten, Konzentrationen, Interaktionen, Konformationen oder Dynamiken von Molekülen berichten und können auf kleine Veränderungen in der molekularen Struktur oder Umgebung reagieren. Resonanzenergieübertragung bietet eine Möglichkeit, intermolekulare Abstände zu untersuchen. Da sie in der Regel nicht zerstörerisch sind, können spektrophotometrische Techniken mit Proben verwendet werden, die nach einem Experiment wiederhergestellt werden müssen. Sie können auch analytische Methoden bereitstellen, die den Bedarf an Radioisotopen oder gefährlichen Reagenzien vermeiden. In Kombination mit Gentechnik und Mikroskopie bieten sie Einblicke in die Position, Dynamik und den Umsatz bestimmter Moleküle in lebenden Zellen.

In diesem Kapitel diskutieren wir die grundlegenden Prinzipien der Quantenmechanik, die der optischen Spektroskopie zugrunde liegen. Umfassendere Behandlungen sind in den klassischen Texten von Dirac [1] und Pauling und Wilson [2], einer Sammlung von historischen Arbeiten, herausgegeben von van der Waerden [3], und zahlreichen neueren Texten [4–10] erhältlich. Atkins [11] ist eine nützliche Quelle für führende Referenzen und prägnante Diskussionen der Hauptideen.

In diesem Kapitel betrachten wir klassische und quantenmechanische Beschreibungen elektromagnetischer Strahlung. Wir entwickeln Ausdrücke für die Energiedichte und Bestrahlungsstärke von Licht, das durch ein homogenes Medium strömt, und wir diskutieren das Plancksche Strahlungsgesetz für schwarze Körper und lineare und zirkulare Polarisation. Leser, die darauf erpicht sind, zu den Wechselwirkungen von Licht mit Materie überzugehen, können zu Kap. 4 vorspringen und bei Bedarf zum vorliegenden Kapitel zurückkehren.

Dieses Kapitel beginnt mit einer Diskussion darüber, wie das oszillierende elektrische Feld des Lichts ein Molekül in einen angeregten elektronischen Zustand versetzen kann. Dann untersuchen wir die Faktoren, die Wellenlänge, Stärke, linearen Dichroismus und Formen von molekularen Absorptionsbanden bestimmen. Unser Ansatz besteht darin, das Molekül quantenmechanisch mit zeitabhängiger Störungstheorie (Kap. 2) zu behandeln, aber das Licht, die Störung, als rein klassisches oszillierendes elektrisches Feld zu betrachten. Da viele der Phänomene, die mit der Absorption von Licht verbunden sind, gut durch diesen semi-klassischen Ansatz erklärt werden können, verschieben wir die Betrachtung der Quantennatur des Lichts auf Kap. 5. Interaktionen mit dem magnetischen Feld des Lichts werden in Kap. 9 diskutiert.

Wir haben gesehen, dass Licht Moleküle von ihren Grundzuständen zu Zuständen mit höheren Energien anregen kann und Abwärtsübergänge von angeregten Zuständen zum Grundzustand stimulieren kann. Aber angeregte Moleküle zerfallen auch zum Grundzustand, selbst wenn die Lichtintensität null ist. Die zusätzliche Energie des angeregten Moleküls kann als Fluoreszenz abgestrahlt, auf ein anderes Molekül übertragen oder als Wärme an die Umgebung abgegeben werden. In diesem Kapitel betrachten wir Fluoreszenz.

Anregungen von Molekülen zu höheren Schwingungszuständen treten typischerweise im mittleren Infrarotbereich des Spektrums zwischen 200 und 5.000 cm⁻¹(λ = 2,5 bis 50 μm) auf. In diesem Kapitel betrachten wir die Hauptfaktoren, die die Energien und Stärken der Schwingungsanregungen bestimmen. Wir betrachten, wie Rotationsbewegungen das Infrarot-Absorptionsspektrum kleiner Moleküle beeinflussen, und wir beschreiben Anwendungen der Infrarotspektroskopie mit Schwerpunkt auf Anwendungen für Proteine und Nukleinsäuren. Kap. 12 geht näher auf die Raman-Spektroskopie ein, bei der Schwingungsübergänge die Streuung von Licht bei höheren Frequenzen begleiten.

Die Förster-Theorie, die wir im letzten Kapitel betrachtet haben, gilt für Moleküle, die weit genug voneinander entfernt sind, so dass die intermolekularen Wechselwirkungen sehr schwach sind. Das Wechseln der Anregungen von einem Molekül zum anderen ist im Vergleich zur Schwingungsrelaxation und Dephasierung, die die homogenen Breiten der Absorptionsbänder bestimmen, langsam und hat wenig Einfluss auf die Absorptionsspektren der Moleküle. Wenn der Energiegeber und -nehmer unterscheidbar sind, könnten wir das gesamte Absorptions- oder stimulierte Emissionsspektrum des Systems untersuchen und zumindest im Prinzip bestimmen, welches Molekül zu einem gewissen Zeitpunkt angeregt ist. Aber angenommen, wir bringen die Moleküle so zusammen, dass die für den Energiesprung von einem zum anderen Molekül benötigte Zeit immer kürzer wird. Irgendwann wird es dann unmöglich sein zu sagen, welches Molekül angeregt ist. In dieser Situation könnten wir erwarten, dass die Resonanz zwischen mehreren angeregten Zuständen dazu führen könnte, dass das Absorptionsspektrum eines Oligomers von den Spektren der einzelnen Moleküle abweicht, und tatsächlich stellt sich heraus, dass dies der Fall ist.

In unserer Analyse, wie ein elektromagnetisches Strahlungsfeld mit Elektronen interagiert, haben wir bis zu diesem Punkt nur das oszillierende elektrische Feld, E(t), berücksichtigt. Wir haben mögliche Auswirkungen des magnetischen Feldes, B(t), beiseite gelassen, weil sie normalerweise viel kleiner sind als die Auswirkungen des elektrischen Feldes. Mit dieser Annahme fanden wir heraus, dass die Stärke der Absorptionsbande für einen Übergang zwischen zwei Zuständen mit Wellenfunktionen ψ_a und ψ_b von dem Quadrat des Skalarprodukts von E_o mit dem elektrischen Dipol-Matrixelement, μ_ba, abhängt. Es gibt jedoch Fälle, in denen die Symmetrie der Wellenfunktionen μ_ba null ergibt, und dennoch hat der Übergang immer noch eine messbare Dipolstärke. Die Absorption in diesen Fällen resultiert manchmal aus Quadrupol-, Oktupol- oder anderen kleinen Termen, die wir bei der Verwendung des Dipoloperators vernachlässigt haben, aber in anderen Fällen kann sie auf Wechselwirkungen mit dem magnetischen Feld zurückgeführt werden. Darüber hinaus können gekoppelte Wechselwirkungen, die sowohl E(t) als auch B(t) betreffen, dazu führen, dass die Dipolstärke eines Übergangs für links- und rechtszirkular polarisiertes Licht unterschiedlich ist. Dies ist Zirkulardichroismus (CD). Eine Diskussion über Zirkulardichroismus wird unser Verständnis davon vertiefen, wie Licht mit Materie interagiert, und einen interessanten Unterschied zwischen klassischen und quantenmechanischen Theorien dieser Wechselwirkungen aufzeigen. Wir werden auch sehen, wie Messungen von CD Einblicke in die Struktur und Dynamik von Systemen mit mehreren Chromophoren liefern können.

Die zeitabhängige Störungstheorie, die wir zur Behandlung von Resonanzenergieübertragung und Lichtabsorption verwendet haben, setzt voraus, dass wir wissen, dass ein System sich in einem gegebenen Zustand (Zustand 1) befindet, so dass der mit diesem Zustand assoziierte Koeffizient (C₁) = 1 ist, während der Koeffizient für das Auffinden des Systems in einem anderen Zustand (C₂) = 0 ist. Der resultierende Ausdruck für die Übergangsrate zum Zustand 2 (Gl. 2.61 oder 7.8) vernachlässigt die Möglichkeit einer Rückkehr zum Zustand 1. Er kann zu späteren Zeiten nur dann weiterhin gelten, wenn der Übergang zum Zustand 2 von einer Relaxation gefolgt wird, die die beiden Zustände aus der Resonanz nimmt. Ohne solche Relaxationen würde das System zwischen den beiden Zuständen oszillieren, wie es die gekoppelten Gleichungen beschreiben

Im letzten Kapitel haben wir eine stationäre Behandlung verwendet, um die Form einer Absorptionsbande mit der Dynamik von Relaxationen im angeregten Zustand in Beziehung zu setzen. Da das Herstellen eines stationären Zustands eine Periode in der Größenordnung der elektronischen Dekohärenzzeit erfordert, gelten die Gl. (10.43) und (10.44) nur auf Zeitskalen, die länger als diese sind. Wir müssen diese Einschränkung überwinden, wenn wir die Relaxationsdynamik selbst erforschen wollen. Unser erstes Ziel in diesem Kapitel ist es, einen allgemeineren Ansatz zur Analyse von spektroskopischen Experimenten auf Femtosekunden- und Pikosekunden-Zeitskalen zu entwickeln. Dies wird eine Plattform für die Diskussion darüber bieten, wie Pump-Probe- und Photonenecho-Experimente verwendet werden können, um die Dynamik von strukturellen Fluktuationen und den Transfer von Energie oder Elektronen auf diesen kurzen Zeitskalen zu untersuchen.

Die in Kap. 6 diskutierten Schwingungsübergänge erfolgen durch Absorption eines Photons, dessen Energie einem Schwingungsenergieabstand, hυ, entspricht. Schwingungs- oder Rotationsübergänge können auch auftreten, wenn ein Molekül Licht höherer Frequenzen streut; dies ist das Phänomen der Raman-Streuung. Raman-Streuung ist eine von einer Gruppe von Zwei-Photonen-Prozessen, bei denen ein Photon absorbiert und ein anderes im Wesentlichen gleichzeitig emittiert wird. Rayleigh-Streuung bezieht sich auf Streuung durch Moleküle oder Partikel, die klein im Verhältnis zur Wellenlänge des gestreuten Lichts sind; Mie-Streuung auf Streuung durch größere Partikel. Rayleigh Streuung und Mie-Streuung sind elastische Prozesse, bei denen es keinen Nettoenergietransfer zwischen dem Molekül und dem Strahlungsfeld gibt: die einfallenden und emittierten Photonen haben die gleiche Energie. Raman-Streuung ist ein inelastischer Prozess, bei dem die einfallenden und abgehenden Photonen in der Energie differieren und das Molekül entweder auf ein höheres Schwingungs- oder Rotationsniveau des Grundelektronenzustands befördert oder auf ein niedrigeres Niveau herabgestuft wird. Raman-Übergänge, bei denen das Molekül Schwingungs- oder Rotationsenergie gewinnt, genannt Stokes Raman-Streuung, dominieren in der Regel über Übergänge, bei denen Energie verloren geht (anti-Stokes Raman-Streuung), weil ruhende Moleküle hauptsächlich die niedrigsten Niveaus aller Schwingungsmoden mit hυ > k_BT bevölkern. Die Stärke der anti-Stokes-Streuung nimmt mit der Temperatur zu, und das Verhältnis von anti-Stokes- zu Stokes-Streuung bietet eine Möglichkeit, die effektive Temperatur eines Moleküls zu messen. Sowohl Stokes- als auch anti-Stokes-Raman-Streuung nehmen stark an Stärke zu, wenn das einfallende Licht innerhalb einer molekularen Absorptionsbande liegt. Die Streuung wird dann als Resonanz-Raman-Streuung bezeichnet.