Biokompatibilitätstestung unterschiedlich sterilisierter bzw. desinfizierter allogener Knochentransplantate im Vergleich zum Goldstandard der autologen Knochenspende - Eine „In-vitro”-Analyse der Immunmodulation

 

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Zusammenfassung

Einführung: Die autologe Knochenspende stellt die natürlichste Methode zur Therapie großer Knochendefekte dar. Nachteil ist, dass nur geringe Mengen an Knochen gewonnen werden können und die Entnahme mit einer deutlich erhöhten Morbidität einhergeht. Die vorliegende Studie untersucht den Einfluss von unterschiedlich sterilisierter- bzw. desinfizierter allogener Knochentransplantate auf die Differenzierung von humanen Knochenmark und vergleicht die Resultate mit der autologen Knochenspende. Methodik: Humane Knochenmarkzellen wurden aus Spongiosa, welche im Rahmen von Hüftgelenkersatzoperationen aus dem proximalen Femurschaft entnommen wurde, kultiviert. Humane Spongiosascheiben, 10 mm Durchmesser, 3 mm Höhe, wurden aus Femurköpfen, die im Rahmen von Hüftgelenkersatzoperationen entfernt wurden, hergestellt und nach unterschiedlichen Verfahren sterilisiert bzw. desinfiziert (γ-Bestrahlung, PES/Ethanol-Behandlung, Tutoplast®-Verfahren, 121 °C Autoklavierung, > 82,5 °C Thermodesinfektion). Zusätzlich wurde in vitro eine autologe Knochenspende simuliert und die Ergebnisse mit der allogenen Knochenspende verglichen. Endobon® wurde als bovine Hydroxylapatitkeramik evaluiert. Über einen Zeitraum von 4 Wochen erfolgte jeden zweiten Tag ein Mediumwechsel (IMDM). Rasterelektronenmikroskopisch wurde eine morphologische Beurteilung durchgeführt. Zur Vitalitätsbestimmung wurde eine Trypanblaufärbung durchgeführt. Zu Beginn der Kultur, sowie nach 4 Wochen wurde eine FACS-Analyse mit spezifischen Antikörpern durchgeführt. Als Kontrollgruppe dienten humane Knochenmarkzellkulturen ohne Knochentransplantate. Ergebnisse: Nach 4 Wochen waren im Durchschnitt, mit Ausnahme der bestrahlten Spongiosascheiben, 2/3 der Zellen vital. Im Vergleich zu den Kontrollkulturen waren über den Zeitraum von 4 Wochen deutliche Unterschiede in der Immunreaktion sowohl beim autologen Versuchsansatz als auch bei den unterschiedlich sterilisierten bzw. desinfizierten allogenen Knochentransplantaten nachweisbar. Die morphologische Analyse wies bei den bestrahlten und autoklavierten Spongiosascheiben Risse in der Trabekeloberfläche nach und konnte bei allen Verfahren eine Penetration der Zellen in die trabekulären Strukturen nachweisen. Schlussfolgerung: Die Ergebnisse belegen eindeutig den Einfluss der verschiedenen Sterilisations- und Desinfektionsverfahren auf die Differenzierung humaner Knochenmarkzellen (Empfängerzellen). Autoklavierung und 82,5 °C Thermodesinfektion erzielten in vitro dem autologen Versuchansatz ähnliche Effekte. Die Behandlung allogener Knochentransplantate mit PES/Ethanol und nach dem Tutoplast®-Verfahren zeigten ebenso wie Endobon® nur geringe Veränderungen im Vergleich zu den Kontrollkulturen. Die Gammabestrahlung allogener Knochentransplantate führte zu einem exzessiven Zelluntergang vermutlich infolge Ausbildung freier Radikale.

Abstract

Introduction: Repair of large skeletal defects using bone allografts has become a routine procedure in orthopaedic and trauma surgery. Different procedures of sterilisation (82.5 °C disinfection; 121 °C autoclaving; PES; Tutoplast®; 25 kGy gamma irradiation) are available to inactivate bacteria and fungi, including their spores, as well as viruses in human bone allografts. The efficiency of these procedures has been proven. However, the effects on the cellular response are rarely investigated. This present in vitro study investigates the immunological answer of human bone marrow cells to human allogenous and autologous bone platelets which were sterilised by different methods. Materials and Methods: Human bone marrow cells and the bone platelets were harvested from patients undergoing a total hip replacement. All patients provided informed consent. Human bone platelets, 10 mm in diameter, 3 mm in height, were produced from femoral heads which were removed within the scope of total hip replacements. They were sterilised by different procedures or were disinfected (γ radiotherapy, PES/ethanol treatment, Tutoplast® procedure, 121 °C autoclaving, > 82.5 °C thermodisinfection). In addition, an autologous in vitro bone donation was simulated and compared with the allogenous bone grafts. Endobon® was evaluated as a bovine hydroxyapatite ceramic. As control a human bone marrow cell culture without bone platelets was used. Over a period of four weeks the changes of the immunogenic cell populations were analysed in vitro (FACS analysis). Light and scanning microscopy were done to reveal morphological differences. As a vitality test the trypan-blue staining was performed. Results: Light and scanning microscopy demonstrated large differences between the various sterilisation and disinfection methods. After 4 weeks the autologous bone platelets were completely covered with homogenously distributed human osteoblast like cells. The heat-sterilised/disinfected transplants demonstrated similar effects compared to the autologous bone grafts while the irradiated bone platelets demonstrated less cell coverage. 2/3 of the cells were vital on average after four weeks, with the exception of the irradiated bone platelets. The FACS analysis revealed in comparison to the control group provable differences in the immunological answer for the autologous bone donation as well as for the differently sterilised or disinfected allogenous bone grafts. The heat sterilisation or, respectively, disinfection methods compared to the autologous bone donation demonstrated almost similar in vitro effects. By far the worst results, characterised by an excessively increased portion of cytotoxic T-cells and a decreased amount of viable cells, were seen in the 25 kGy gamma irradiation samples. Conclusions: The results demonstrate the influence of the different sterilisation and disinfection procedures on the differentiation of human marrow cells (host). Similar in vitro effects were seen for the autologous and heat-treated bone platelets. The treatment of allogenous bone grafts with PES/ethanol and the Tutoplast® procedures showed, just as Endobon®, only low differences in comparison with the control cultures. The worse results in the case of the irradiated bone platelets may be explained by the production of free radicals which led to an excessive cell death.

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Dr. med. S. Endres

Klinik für Orthopädie und Rheumatologie der Philipps-Universität Marburg

Baldingerstraße

35033 Marburg

Email: endres@med.uni-marburg.de