Resumos

BIOTECNOLOGIA

Atividade antimicrobiana de fungos endofíticos isolados de plantas tóxicas da amazônia: Palicourea longiflora (aubl.) rich e Strychnos cogens bentham

Antimicrobial activity of endophytic fungi isolated from amazonian toxic plants: Palicourea longiflora (aubl.) rich and Strychnos cogens bentham

Antonia Queiroz Lima de Souza^I; Afonso Duarte Leão de Souza^II; Spartaco Astolfi Filho^II; Maria Lúcia Belém Pinheiro^II; Maria Inez de Moura Sarquis^III; José Odair Pereira^II

^IMestra em Genética e Evolução pela Universidade Federal de São Carlos / Universidade Federal do Amazonas, e-mail: antoniaqlsouza@yahoo.com.br

^IIUniversidade Federal do Amazonas

^IIIFundação Oswaldo Cruz – RJ

RESUMO

Das plantas tóxicas da Amazônia Palicourea longiflora e Strychnos cogens foram isolados 571 fungos endofíticos e 74 bactérias endofíticas. Palicourea longiflora (Rubiaceae) e outras espécies desse gênero estão relacionadas a 90% das mortes de gado na região Amazônica. Strychnos cogens (Loganiaceae) e outras espécies de Strychnos são utilizadas pelos indígenas na confecção de "curares". Entre os endófitos isolados de P. longiflora foram identificados os fungos: Colletotrichum sp. e seu telemorfo Glomerella sp., Guignardia sp., Aspergillus niger, Phomopsis sp. e Xylaria sp., além da bactéria Burkholderia gladioli, pertencente a um grupo de fixadoras de nitrogênio. Dos isolados de S. cogens foram identificados os fungos: Colletotrichum sp., Guignardia sp., Aspergillus niger e Trichoderma sp. Uma amostra de 79 isolados fúngicos teve seus metabólitos extracelulares bioensaiados contra microrganismos patogênicos e fitopatogênicos: 19 isolados inibiram um ou mais microrganismos-teste. Dos oito isolados com melhores resultados de inibição, as móleculas bioativas eram menores que 12.000 daltons, fato verificado pela diálise dos metabólitos.

Palavras-chave: Palicourea longiflora, Strychnos cogens, fungos endofíticos, bactérias endofíticas, bioensaios.

ABSTRACT

Palicourea longiflora (Rubiaceae), a toxic plant from the Amazon belonging to the genus related to 90% of cattle death in the region, and Strychnos cogens (Loganiaceae)belonging to a genus whose plants are used by Indians for manufacturing "curares", were sources of 571 fungi isolates and 74 bacteria isolates. The fungi Colletotrichum sp., Guignardia sp., Aspergillus niger, Glomerella sp., Phomopsis sp. and Xylaria sp. and the endophytic bacterium Burkholderia gladioli were identified from P. longiflora, while the fungi Colletotrichum sp., Guignardia sp., Aspergillus niger and Trichoderma sp. were identified from S. cogens. Bioassays of fungi metabolites excreted by 79 isolates against pathogenic and phytopathogenic microorganisms showed that 19 products inhibited at least one of the microorganisms tested. Through metabolite dialysis it was possible to check the eight best inhibition results, observing that the bioactive molecules were smaller than 12.000 daltons.

Key words: Palicourea longiflora, Strychnos cogens, Endophytic fungi, Endophytic bacterium, bioassay.

INTRODUÇÃO

O Brasil detém cerca de 20% da biodiversidade mundial, principalmente, na floresta Amazônica, a maior do Planeta e fonte inestimável de matérias-primas nos mais variados setores. Apesar da imensa diversidade biológica amazônica, as espécies que a compõem e suas relações filogenéticas são pouco conhecidas, muito menos seus microrganismos e suas interações com outros seres.

Uma parcela dos microrganismos, principalmente bactérias e fungos, habita o interior das plantas. São os endófitos que, segundo Petrini (1991), colonizam os tecidos sadios de partes aéreas da planta, em algum tempo do seu ciclo de vida, sem lhe causar danos aparentes. Este conceito também é estendido aos microrganismos das raízes. Os endófitos diferem dos epífitos que vivem na superfície dos vegetais, e dos fitopatógenos, que lhes causam doenças. Entre os microrganismos endofíticos, os fungos e bactérias que formam nódulos nas raízes das plantas as quais estão associados são bastante estudados devido sua importância na agricultura, particularmente por sua participação na fixação de nitrogênio pelas plantas. Ao contrário, os endófitos das partes aéreas dos vegetais só recentemente têm despertado o interesse da comunidade científica, especialmente por seus potenciais na produção de metabólitos de interesse econômico, incluindo os relacionados às plantas hospedeiras.

As interações endófito/planta, ainda não são muito bem compreendidas, mas podem ser simbióticas, neutras ou antagônicas (neste caso, estudadas pela fitopatologia). Nas interações simbióticas os microrganismos produzem ou induzem a produção de metabólitos primários e secundários que podem conferir diversas vantagens à planta tais como: a diminuição da herbivoria e do ataque de insetos, o aumento da tolerância a estresses abióticos e o controle de outros microrganismos (Araújo, 1996; Rodrigues & Dias Filho, 1996; Pereira, 1993). Exemplo de metabólitos que podem ser induzidos pelos endófitos são as fitoalexinas, substâncias de baixo peso molecular com atividades antimicrobianas, produzidas pelas plantas ante a ação de microrganismos ou de agentes estressantes (Cordeiro Neto & Dietrich, 1992). Da parte dos fungos pode-se citar a produção de micotoxinas, metabólitos secundários que podem causar doenças em humanos e outros animais (Clay, 1988; D'Mello & Macdonald, 1997).

Os endófitos são potencialmente úteis na agricultura e na indústria, particularmente na alimentícia e farmacêutica. Podem ser utilizados como vetores para introdução de genes de interesse nas plantas (Fahey, 1988; Murray et al., 1992), como agentes inibidores de pragas e patógenos (Volksch et al., 1992; Hallmann & Sikora, 1996) e como fontes de metabólitos primários (Stamford et al., 1998) e secundários de interesse como o taxol, poderoso anticancerígeno (Stierle et al., 1993; Wang et al., 2000), a cryptocandina, lipopeptídeo antimicótico (Strobel et al., 1999) e diversos outros antibióticos. Relatos como o do taxol, inicialmente isolado de Taxus brevifolia e, em seguida, de diversos endófitos desta e de outras plantas que o produzem, sugerem um relacionamento entre planta e microrganismo que deve ser melhor explorado.

Neste contexto, pretende-se contribuir para o conhecimento da diversidade e do potencial biotecnológico dos microrganismos da Amazônia, em especial dos fungos endofíticos isolados de plantas tóxicas das espécies Palicourea longiflora (Rubiaceae) e Strychnos cogens (Loganiaceae). Várias espécies do gênero Palicourea são citadas em 90% dos casos de mortes de gado na Região Amazônica (Tokarnia et al., 1979) e plantas do gênero Strychnos são usadas por indígenas para a confecção dos venenos de flechas denominados "curares" (Belém-Pinheiro, 2000). P. longiflora, é homóloga à P. marcgravii (Taylor, comunicação pessoal, 2001), conhecida pelos nomes populares de "cafezinho", "café bravo", "erva de rato", "roxa", "roxinha", "roxana", "vick" e "cambará". Ambas são arbustos de lugares sombreados e invadem capoeiras e pastos recém formados de terra firme, onde ocorrem, sendo P. marcgravii, uma das oito plantas identificadas no Brasil como causadoras da síndrome de "mortes súbitas" em bovinos e a planta tóxica mais largamente distribuída (Tokarnia et al., 1979; Gorniak et al., 1989). Plantas americanas do gênero Strychnos, da família Loganiaceae, têm história na medicina popular como antimaláricas, tônicas, afrodisíacas, febrífugas e anti-anêmicas (Quetin-Leclercq et al., 1990). As espécies sulamericanas têm sido muito estudadas devido à ação dos alcalóides quaternários, componentes dos "curares", juntamente com a d-tubo curarina, isolada de Menispermaceae, que revolucionaram o arsenal terapêutico das cirurgias, inspirando uma linha de mio-relaxantes sintéticos, coadjuvantes em anestesias (Belém- Pinheiro, 2000). A espécie S. cogens Bentham apresenta-se como uma liana de porte médio, encontrada principalmente em terra-firme, sendo comum nas vizinhanças de Manaus (Krukoff, 1972). Não existem na literatura estudos sobre o potencial biotecnológico de endófitos dessas plantas tóxicas da Amazônia.

MATERIAL E MÉTODOS

Material Vegetal

P. longiflora (Aubl.) Rich, identificada pela doutora Charlotte Taylor do Missouri Botanical Garden, foi coletada no interior da floresta ou próximo de pastagens na Fazenda Experimental da Universidade Federal do Amazonas, no Km 42 da BR-174, Manaus-Caracaraí (local I) e numa área de capoeira na Reserva Adolfo Ducke, pertencente ao Instituto Nacional de Pesquisa da Amazônia, no Km 26 da AM-10, Manaus-Itacoatiara (local II). Para isolamento de endófitos (fungos e bactérias) foram utilizados fragmentos de folhas e caules, além de frutos verdes e maduros para isolamento apenas de bactérias.

Strychnos cogens Bentham, identificada por pesquisadores do projeto Flora – INPA, foi coletada no interior da floresta próxima de Manaus, na Estrada Manaus-Itacoatiara, Km 76 (local III). Para o isolamento dos fungos endofíticos foi realizada uma coleta, de um único indivíduo, do qual foram utilizados fragmentos de folhas, do caule e da raiz.

Esterilização do Material e Isolamento dos Endófitos

O material botânico coletado foi processado no prazo de 24 horas, após a coleta, tendo sido lavado abundantemente com água corrente e detergente neutro para retirar o excesso de epifíticos. Em seguida, em câmara asséptica, o material foi imerso em álcool 70% por 1 minuto, em hipoclorito 3% por 4 minutos e novamente em álcool 70% por 30 segundos, para retirar o excesso de hipoclorito. Lavou-se, então, em água destilada estéril da qual se retirou 50 µL para fazer o controle da assepsia (Pereira, 1993).

Após a assepsia, pequenos fragmentos medindo aproximadamente 8 x 8 mm foram plaqueados em meio de batata, dextrose e ágar (BDA) com 0,2% de extrato de levedura, acrescido de terramicina (100mµmL), para inibir o crescimento bacteriano no isolamento dos fungos, e benlate (1µg/mL), para inibir o crescimento fúngico no isolamento das bactérias. As placas com os fragmentos foram incubadas a 18 ºC (Guimarães, 1998).

A partir do terceiro dia de incubação, pequenos fragmentos de ágar com hifas dos fungos recém desenvolvidas foram transferidos para tubos de ensaios contendo meio BDA inclinado. Este procedimento durou oito dias consecutivos. Os isolados de bactérias começaram a ser transferidos após 24 horas de incubação para tubos de penicilina com meio BDA soft acrescido de 10% de água de coco.

Conservação e Frequência dos Endófitos

Após o isolamento dos endófitos a purificação foi feita, quando possível, pela Técnica de Tween (Azevedo & Costa, 1973) ou por sucessivos repiques. Os isolados fúngicos que apresentaram estrutura reprodutiva, foram armazenados em triplicata, conforme a metodologia de Castellani (1939). Os que não apresentaram estrutura reprodutiva foram cultivados em BDA, em triplicata, bem como os isolados bacterianos que foram purificados pelo método do esgotamento por estrias cruzadas e armazenados a 4 ºC. As frequências dos endófitos foram calculadas através do número de colônias obtidas dividido pelo número de fragmentos incubados.

Identificação dos Fungos Endofíticos

Para a identificação foi feito o micro-cultivo e observados os aspectos macro e micro-morfológicos das estruturas vegetativas e reprodutivas. Os resultados foram comparados com base em literatura específica.

Ensaios Biológicos

Foram escolhidas aleatoriamente 79 linhagens de fungos endofíticos, sendo 64 isolados de P. longiflora e 15 de S. cogens, representando, respectivamente, 15,4% e 25,4% do total de isolados de cada espécie. Após cultivados por oito dias em placas de petri com meio BDA, foram retirados fragmentos do meio com 6 x 6 mm para fermentação em 10 mL de BD (acrescido de 0,2% de extrato de levedura) a 25 ºC, a 120 r.p.m., por oito dias. Decorrido este tempo o micélio foi separado do meio metabólico por filtração em papel Whatman, nº 4. O líquido foi novamente filtrado em membrana millipore (0,22 µm ou 0,45 µm) e armazenado a 4 ºC para realização dos ensaios antimicrobianos, contra os seguintes microrganismos:

a) Bacillus sp. (linhagem VRF13 2.2) – bactéria endofítica isolada da macrófita aquática Vitoria amazonica, conhecida como vitória-régia, planta peculiar da Amazônia. Esta bactéria possui a particularidade de ser extremamente sensível a diferentes antibióticos em baixas concentrações.

b) Bacillus subtilis – bactéria Gram-positiva não patogênica, porém considerada similar à B. cereus, responsável por diarréias, náuseas e vômitos.

c) Staphylococcus aureus – bactéria Gram-positiva, patogênica, causadora de doenças respiratórias e cardíacas e principal causadora de infecções hospitalares.

d) Escherichia coli - bactéria Gram-negativa, patogênica para humanos e animais.

e) Candida albicans - fungo leveduriforme, patogênico, responsável pela candidíase no trato vaginal e oral.

f) Trichoderma sp. – fungo filamentoso, fitopatogênico e produtor de metabólitos de interesse industrial.

g) Aspergillus flavus – fungo filamentoso, patogênico, principal espécie produtora de micotoxinas encontradas nos alimentos, mais especificamente em sementes, sendo causadora de grandes prejuízos econômicos.

Foram realizados testes semi-quantitativos, em triplicata, in vitro, para avaliar a antibiose dos metabólitos extracelulares presentes nos meios fermentados contra as linhagens-teste. A metodologia utilizada foi a do líquido metabólico, também conhecido como método do filtrado ou para detecção de antibióticos (Kawamoto & Lorbeer, 1976). As linhagens dos microrganismos-teste, cultivadas em meios líquidos, foram semeadas com alça de Drigalski (50 µL) em placas de Petri contendo o meio especifico para cada uma (cup plate). Para A. flavus, 1 mL da suspensão de conídios foi incorporado ao meio de cultura de cada placa (Pourl plate). Para Trichoderma sp. foi colocado um fragmento de ágar contendo suas hifas no centro da placa. Aplicaram-se 100 µL do líquido metabólico em poços de 8 mm seguindo-se a incubação por 24-72 horas. Os resultados foram registrados considerando-se os valores médios das três repetições.

Entre as amostras de líquidos metabólicos mais promissores, oito foram submetidos à diálise, colocando-se 2 mL de cada em sacos de celulose com capacidade de retenção para 12.000 daltons. Os sacos foram amarrados e colocados em água destilada por nove horas. Os metabólitos retidos nos sacos foram coletados e novamente submetidos aos ensaios antimicrobianos.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

As folhas de P. longiflora quando mergulhadas no hipoclorito sofreram oxidação, ficando escuras mais rapidamente que as folhas de outras plantas analisadas no Laboratório de Genética-UFAM, ocasionando uma redução na quantidade de microrganismos isolados. Em casos de folhas muito jovens a oxidação acentuava ainda mais o decréscimo do número de isolados endofiticos. O mesmo processo foi utilizado para as amostras vegetais de S. cogens, porém não foi observada a rápida oxidação.

Endófitos isolados

Foram obtidos 571 isolados fúngicos dos quais 59 de S. cogens e 512 de P. longiflora. Desta última, também foram isoladas 74 bactérias endofíticas (Tabela 1) perfazendo um total de 645 isolados. Os primeiros isolados bacterianos (14) cresceram em placas de Petri contendo o meio de cultura BDA, acrescido de terramicina, sugerindo tratar-se de espécies resistentes a este antibiótico. Estas bactérias foram percebidas após o repique para os tubos com BDA inibindo o crescimento dos fungos: Guignardia e Colletotrichum, ambos considerados fitopatógenos. O uso de alternativas ecologicamente corretas para o controle de fitopatógenos será num futuro próximo uma das aplicações dos endófitos, e estas bactérias isoladas, poderão então ser avaliadas.

Frequência dos Fungos Endofíticos

A Tabela 2 apresenta a frequência estimada dos fungos endofíticos para as plantas P. longiflora e S. cogens. De forma geral houve uma maior frequência de fungos endofíticos nas folhas dos hospedeiros que nos caules, decrescendo ainda mais para a raiz de S. cogens. Este fato sugere que após a entrada dos microrganismos, principalmente através das folhas, ocorre uma migração para os diferentes tecidos das plantas. Estas apresentam tecidos mais frágeis e expostos, devido aos estômatos, prováveis portas de entrada para os endófitos.

Percentagens elevadas de ocorrência dos fungos endofíticos também foram descritas para as folhas das plantas tropicais Pueraria phaseoloides (72,5%) e Theobroma grandiflorum (58,7%) por Galvão (1998). Quanto à freqüência destes endófitos nos caules não foram encontrados dados consistentes para comparar com os deste trabalho, entretanto, a menor taxa de frequência foi observada nas amostras coletadas da reserva Adolfo Ducke onde houve o aparecimento de bactérias endofíticas, inclusive com maior incidência delas no caule.

Bactérias Endofíticas em P. longiflora

A avaliação nos tecidos foi realizada a partir do isolamento da última coleta, sendo evidenciado um maior número de bactérias endofíticas nos caules (195) e nos frutos verdes (539) do que nos frutos maduros (62) e nas folhas (nove). Contudo o elevado número de bactérias endofíticas observado nos frutos verdes deve-se ao fato de que um único fruto (MgFV37) apresentou 429 isolados bacterianos, 60 dos quais foram selecionados aleatoriamente para juntamente com os 14 da primeira coleta serem preservados para futuros trabalhos.

A presença das bactérias endofíticas no caule em quase todas as placas utilizadas para o isolamento é um fato que deve ser pesquisado mais detalhadamente, pois, enquanto o número de bactérias é alto no caule decresce para as folhas, o inverso do observado em relação aos fungos para este hospedeiro.

Identificação e Importância dos Fungos Endofíticos

A identificação completa dos fungos endofíticos não é fácil, devido à carência de especialistas em taxonomia das diferentes espécies e de conhecimento sobre seus micro habitat, podendo haver, entre eles muitas espécies inéditas. Os isolados que apresentaram estruturas reprodutivas, foram classificados após observação dos aspectos macro e micro morfológicos, comparados com dados específicos de literatura. Foram identificados até o nível de gênero: Colletotrichum, Guigniardia e Aspergillus isolados das duas plantas; Phomopsis, Glomerella e Xylaria de P. longiflora e Trichoderma de S. cogens. Fungos endofíticos destes gêneros foram isolados de outras plantas tropicais tais como Theobroma grandiflorum, Pueraria phaseoloides e Scleria pterota (Galvão, 1998). Similarmente Pereira et al. (1993) isolaram de Stylosantes guianensis e Musa spp.: Aspergillus e Trichoderma entre outros fungos endofíticos. Outros fungos, especialmente os que não apresentaram estruturas reprodutivas não foram identificdos.

Espécies do gênero Guignardia são citadas como os agentes da podridão da videira e da doença "mancha negra" nas culturas de citros (Glienke-Blanco, 1999), causando grandes perdas econômicas. Os isolados das espécies deste gênero (29) foram purificados e após oito dias de cultivo em BDA notava-se claramente diferenças morfológicas entre eles. Diferenças morfológicas neste grupo já haviam sido descritas por Glienke-Blanco (1999) para um período de crescimento de 3-4 semanas e meio de cultura diferente – Meio Completo (MC). Outros grupos, inclusive Colletotrichum guaranicola, apresentam variações morfológicas e fisiológicas (Duarte et al., 1995) o que dificulta a identificação dos fungos. Por isso têm sido desenvolvidos novos métodos que envolvem desde a triagem dos metabólitos até o estudo da variabilidade do DNA por técnicas de PCR (Fungaro, 2001).

Phomopsis é um ascomiceto, anamórfico de Diaporthe, cujo habitat é o caule de plantas lenhosas e herbáceas (Hanlin & Menezes, 1996). É o agente causal da queima da haste de soja e da podridão de seus frutos e de outras sementes.

Espécies de Glomerella são encontradas como parasitas ou saprófitas nos tecidos de plantas vasculares. Seu telemorfo Colletotrichum está relacionado com a antracnose. Seu mais reconhecido representante é G. cingulata (Stonemam) Spauld. & H. Schrenk, agente causal da podridão amarga da maçã e da antracnose em diferentes culturas (Hanlin & Menezes, 1996).

Apesar dos gêneros Guignardia, Colletotrichum, Phomopsis e Glomerella serem considerados fitopatógenos, estes isolados foram obtidos a partir de plantas sadias sem qualquer doença aparente.

Identificação e Importância das Bactérias Endofíticas

As 14 bactérias isoladas na reserva Adolfo Ducke, foram submetidas a ensaios de antibiograma e apresentaram resistência aos antibióticos clorafenicol 20 µg/mL, terramicina 100 µg/mL e tetraciclina 20 µg/mL. Foram identificadas por Souza et al. (2001), num estudo envolvendo a diversidade de bactérias endofíticas de diferentes plantas tropicais, através do sequenciamento do DNA ribossomal região 16S (SSU-rDNA). As linhagens foram identificadas como Burkholderia gladioli, pertencentes a um grupo de fixadoras de nitrogênio. "Em solos muito pobres como o da Amazônia, a presença de bactérias endofíticas fixadoras de nitrogênio ajuda a entender tamanha exuberância e riqueza da flora e, consequentemente, da fauna" (Pavan e Moreira-Filho, 1998). Vale ressaltar que Benvivino et al. (1994) relataram que isolados de B. cepacia foram capazes de reduzir o crescimento de fungos fitopatogênicos em meio artificial, coincidindo com o fato observado por nós para B. gladioli, quando da sua obtenção.

O grupo Burkholderia é composto por várias espécies que tem sido isoladas da rizosfera de diversos vegetais, de pacientes com fibrose cística (Whitby et al., 2000) e recentemente, de algumas plantas tropicais como cana-de-açúcar, gramíneas (Baldani, 1996), arroz (Gillis et al., 1995), mandioca (Belota, 1994) e abacaxi (Weber et al., 2000). Coenye et al. (2000) fizeram a comparação das sequências da região 16S rDNA de Pseudomonas antimicrobica e constataram que ela pertencia ao grupo Burkholderia. Posteriormente sua hibridização DNA-DNA confirmou que P. antimicrobica e B. gladioli representam a mesma espécie. Segundo Matssura (1998) é difícil encontrar substâncias inibidoras para este grupo, o que está de acordo com a resistência observada para estas bactérias nos resultados obtidos pelo antibiograma realizado.

Utilizando linhagens de B. gladioli oriundas de seringueira (Hevea brasiliensis), de mandioca (Manihot esculenta (cassava) e de bananeira (Musa sp), conservadas em uma biblioteca genômica, Reiter et al. (2000) realizaram uma triagem sobre atividade esterolítica e constataram uma homologia significante entre as enzimas produzidas por elas e pelos vegetais das quais foram isoladas. Weber et al. (2000) selecionaram bactérias diazotróficas isoladas de bananeiras (Musa spp.) e avaliaram sua influência no crescimento de mudas micropropagadas. As bananeiras cv. caipira cresceram melhor com os inóculos de Burkholderia.

Até pouco tempo se desconhecia a importância das bactérias diazotróficas, que utilizam o nitrogênio como fonte de seu metabolismo. Com o início da chamada "Revolução Verde" começaram os estudos com estas bactérias ligadas ao solo e mais recentemente com as oriundas das partes aéreas das plantas, tendo sido comprovado que 60% do nitrogênio fixado pela cana-de-açúcar é resultado do metabolismo das bactérias endofíticas da parte aérea (Baldani, 1996). A afinidade com as plantas pode fazer de Burkholderia spp. um possível vetor para introdução de genes de interesse.

Atividade Antibiótica dos Metabólitos Extracelulares

Os microrganismos podem produzir uma variedade muito grande de metabólitos tanto primários quanto secundários, incluindo enzimas (Stamford et al., 1998), aminoácidos (Kleinkauf & Von Dohren, 1990), vitaminas, antibióticos, pigmentos (Demain, 1992), agentes moduladores de respostas imunológicas (Trilli et al., 1978), toxinas (Bach & Kimati, 1999), agentes anti-tumorais (Wang et al., 2000), fatores de crescimento de plantas (Alexopoulos, 1996), anti-helmínticos (Rodrigues et al., 2000) e anti-micóticos (Li et al., 2001; Li & Strobel, 2001).

Dos líquidos metabólicos das 79 linhagens de fungos endofíticos selecionadas para os ensaios de antagonismo in vitro, 19 (24,05%) apresentaram atividades antagônicas contra um ou mais microrganismo-teste utilizados nestes ensaios (Tabela 3; Figuras 1, 2 e 3). Candida albicans e Trichoderma sp. não foram inibidos pelos metabólitos de nenhuma das linhagens selecionadas. Em alguns casos os metabólitos ao invés de inibirem o crescimento das bactérias ocasionaram sua maior propagação, fato também observado por Araújo (1996) ao realizar ensaios de culturas pareadas entre bactérias endofíticas, isoladas de citrus, com diferentes fungos.

Espécies de Xylaria são naturalmente encontradas em árvores mortas como saprófitas (Hanlin & Menezes, 1996). Pereira (1993) relata com base nos trabalhos de Rodrigues & Samuels (1990) e Rodrigues & Samuels (1992) que espécies de Xylaria são isoladas de plantas tropicais com maior frequência que de plantas de clima temperado, sendo capazes de sintetizar celulases e ligninases e podendo atuar como patógenos latentes ou como decompositores. Em trabalho recente na Alemanha, Stadler et al. (2001) isolaram do estroma de Daldinia concentrica, ascomiceto da família Xylariaceae (mesma família de Xylaria), o triterpenoide concentricol. Eles ainda relatam que, recentemente, um grupo de pesquisadores japoneses descobriu mais de 20 novos metabólitos, produzidos por duas espécies de Daldinia no Japão. Os metabólitos secundários de espécies européias e americanas deste grupo tem sido muito bem investigado.

Outro importante trabalho realizado com Xylaria sp. envolve a descoberta de um novo sesquiterpenóide que inibe a enzima integrase do vírus HIV-1, uma das três responsáveis por sua replicação. Esta enzima está ausente no homem, parecendo ser muito especifica do HIV-1 sendo, portanto, um alvo potencial para o desenvolvimento de agentes anti-HIV de alta seletividade (Singh et al., 1999). Embora a linhagem de Xylaria (MgF8a 2.3), isolada de P. longiflora, tenha apresentado fraca ação antibiótica contra Bacillus sp. seria importante no futuro desenvolver pesquisas envolvendo este gênero.

Fungos do gênero Trichoderma tem sido isolados de solos e também como endofítico, porém com menor freqüência. Suas linhagem têm sido relatadas pelo antagonismo in vitro a diversos fungos, entre eles: Sclerotium rolfsii agente causador da podridão seca do talo do tabaco (Velásquez & Pineda, 1995), Verticillium dahliae causador da murcha verticilar na cultura de beringela (Martins-Cordeiro & Melo, 1998) e, recentemente, Crinipellis perniciosa, agente causal da vassoura de bruxa, doença que dizima as culturas de cacau. Entretanto, não são todas as linhagens de Trichoderma que apresentam atividade antibiótica, pois esta capacidade pode variar de indivíduo para indivíduo ou mesmo estar ausente como ocorreu com outras linhagens de Trichoderma testadas durante este trabalho. A linhagem de Trichoderma StC1 2.4, isolada do caule de S. cogens, além de apresentar atividade antibiótica contra E. coli foi a única a inibir o crescimento de A. flavus (Figura 3A). Futuras investigações serão realizadas com StCl 2.4, devido o potencial farmacológico da planta hospedeira e do endófito.

O grupo Aspergillus compõe-se das principais espécies de microrganismos produtores de enzimas de interesse alimentício, com utilidades tais como a clarificação de sucos de frutas (pectinases), fabricação de xaropes (amilases) (Peppler & Reed, 1988) e a produção do ácido cítrico (Azevedo, 1997). São também descritos como produtores de micotoxinas junto com as espécies de Fusarium (Mallozi & Corrêa, 1998) sendo, portanto, de interesse tanto econômico quanto médico. As linhagens isoladas de P. longiflora e de S. cogens apresentaram atividade antibiótica para às linhagens-teste de Bacillus sp., B. subtilis, Staphylococcus aureus e Escherichia coli, enquanto que uma linhagem controle de Aspergillus niger, isolada da atmosfera, não apresentou atividade. Tais resultados ratificaram a importância da escolha do hospedeiro, pois durante a coevolução do endófito e de seu hospedeiro pode ocorrer a transferência de gens (Azevedo, 1998).

O gênero Colletotrichum está relacionado à pinta preta e à antracnose do guaraná. Hong Lu et al. (2000), na China, conseguiram isolar de Colletotrichum sp. um novo metabólito bioativo para inibição de Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Sarcina lutea e Pseudomonas sp. Este microrganismo tinha sido isolado de Artemisia annua, planta medicinal de onde se extrai a artemisinina, droga antimalárica. De Artemisia mongolica foi isolado Colletotrichum gloeosporioides com as mesmas atividades acima citadas para Colletotrichum sp. (Zou et al., 2000; Hong Lu et al., 2000). Coincidentemente, duas linhagens de Colletotrichum sp. aqui ensaiadas apresentaram atividades antibióticas frente a Bacillus sp., B. subtilis (Figura 3 B e C) e Staphylococcus aureus (Tabela 3).

Diálise dos Metabólitos Extracelulares

Os líquidos metabólicos das oito linhagens de endófitos consideradas as mais promissoras através dos bioensaios foram dialisados com o objetivo de avaliar o tamanho das moléculas responsáveis pela atividade antimicrobiana. Dessas linhagens quatro eram do grupo Aspergillus niger, duas Colletotrichum sp., uma Trichoderma sp. e uma está em fase de classificação (StC1 4.5).

Após a diálise os líquidos retidos, foram recolhidos e submetidos aos ensaios antimicobianos. Todos perderam a atividade antagônica, enquanto os controles, líquidos metabólicos não dialisados, mantiveram-se ativos (Figura 4).

Com base nos resultados das diálises pôde-se inferir que os metabólitos extracelulares bioativos produzidos por estas oito linhagens possuem peso molecular menor que 12.000 daltons, porém, não foi possível saber exatamente quais substâncias apresentam atividades antibióticas. Com este objetivo, estudos químicos de algumas dessas linhagens estão em andamento e novos testes antimicrobianos com estas e outras linhagens-teste serão realizados.

Por fim, pretende este trabalho ser uma contribuição para a compreensão das interações endófitos/plantas e abrir novas perspectivas sobre o potencial biotecnológico dos microrganismos endofíticos de plantas da Amazônia, praticamente inexplorada neste campo, porém, como constatado, com grandes potencialidades.

AGRADECIMENTOS

À Universidade Federal do Amazonas e à Universidade Federal de São Carlos pelo convênio com a Pós-graduação em Genética e Evolução. À Dra. Charlotte Taylor do Missouri Botanical Garden, pela identificação do material botânico de Palicourea longiflora. Ao Dr. Itamar Soares de Melo da EMBRAPA, à Marinês Rodrigues e ao Prof. Januário Santos do Departamento de Microbiologia da UFAM, pelas linhagens de microrganismos testadores cedidas. À Dra. Suzilei França da UNAERP e ao Prof. Isaac Leews da FACED/UFAM pelo abstract. Ao Dr. Webber, do Laboratório de Botânica da UFAM, pela ajuda na localização de P. longiflora. À CAPES pelo apoio financeiro.

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Recebido em 14/11/2002

Aceito em 06/04/200

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