Produktion von Oleanol- und Ursolsäure mit pflanzlichen in vitro Kulturen

Dieses Kapitel führt den Leser in die Produktion sekundärer Pflanzenstoffe im Speziellen der Triterpensäuren Oleanol- und Ursolsäure ein. Dabei werden die wesentlichen Problemstellungen, die bisherige Bestrebungen der Kommerzialisierung des Verfahrens oder vergleichbarer Prozesse hindern, aufgezeigt. Diese stellen die Schwerpunkte der vorliegenden Arbeit dar und werden in den folgenden Kapiteln näher beschrieben und untersucht.

Wilson S.A. & S.C. Roberts (2012): Recent advances towards development and commercialization of plant cell culture processes for the synthesis of biomolecules. Plant Biotechnol J 10 (3): 249–268. https://​doi.​org/​10.​1111/​j.​1467-7652.​2011.​00664.​x.

Yue W., Q. Ming, B. Lin, K. Rahman, C.-J. Zheng, T. Han & L. Qin (2016): Medicinal plant cell suspension cultures: pharmaceutical applications and high-yielding strategies for the desired secondary metabolites. Crit Rev Biotechnol 36 (2): 215–232. https://​doi.​org/​10.​3109/​07388551.​2014.​923986

Dieses Kapitel bereitet dem Leser einen Überblick über die Themenbereiche, welche in dieser Arbeit angesprochen werden. Zunächst werden pflanzliche in vitro Kulturen allgemein und hormonautotrophe Pflanzenzellkulturen mit deren Vorzügen im Vergleich zu anderen in vitro Kultursystemen zur Produktion pflanzlicher Wirkstoffe vorgestellt. Dem schließen sich Einblicke in die Biosynthese, Anwendungsbereiche und den aktuellen Stand der Analysenmethoden zur Bestimmung von Oleanol- und Ursolsäure an. Ergänzend werden Möglichkeiten zur Aufarbeitung der beiden Säuren aus pflanzlichen Zellkulturen von Kenntnissen aus der Bioverfahrenstechnik allgemein sowie der Wirkstoffgewinnung aus pflanzlichem Material aufgeführt. Einen weiteren Schwerpunkt stellt die Kryokonservierung pflanzlicher Zellkulturen dar. Abschließend wird ein Überblick über aktuelle Arbeiten und Strategien zur Erhöhung der Produktivität pflanzlicher Zellkulturen gegeben.

In diesem Kapitel wird das methodische Vorgehen zur Untersuchung der eingangs gestellten Fragestellungen beschrieben. Der Leser erhält einen Überblick über verschiedenste Techniken zur Analyse und Aufarbeitung der Triterpensäuren aus pflanzlichem Material, die in dieser Arbeit angewandt wurden. Die Parameter der in vitro Kultur und die Erzeugung hormonbasierter Pflanzenzellkulturen von Basilikum, Salbei und Rosmarin werden beschrieben. Eine geeignete Methode zur Kryokonservierung von Salbeizellen wird vorgestellt. Anschließend werden Elizitierung und ein fed-batch mit Saccharose auf ihre Eignung zur Erhöhung der Triterpensäure-Produktivität von Salbeizellkulturen untersucht.

In diesem Kapitel werden die Ergebnisse der Untersuchungen ausführlich dargelegt und umfassend diskutiert. Die chromatographischen Analysen von pflanzlichem (in vitro) Material verschiedener Vertreter der Lamiaceae ergaben eine große Variation der Triterpensäuregehalte zwischen den Proben. In Bezug auf ihren Triterpensäuregehalt und ihr Wachstumsverhalten stellte sich dabei eine hormonbasierte Zellsuspension von Salvia fruticosa als besonders vielversprechend heraus. Ein Metabolitscreening von Zellsuspensionen verschiedener Salbeispezies offenbarte das Vorhandensein weiterer pharmakologisch wirksamer Substanzen wie z.B. Phenolsäuren und Sterole. Für die Gewinnung der Triterpensäuren aus der Zellsuspension eignet sich die Filtration mit anschließender Mazeration oder Hochdruckhomogenisation der Zellmasse in Ethanol. Weitere Sektionen schildern die Etablierung einer Methode zur Kryokonservierung der Zellen im Zwei-Schritt-Verfahren mit verkürzter Subkultur sowie Ansätze zur Steigerung der Produktion durch Elizitierung mit Pilzkulturen und einem Saccharose fed-batch. Als Alternative zur hormonbasierten Zellkultur wird die Etablierung hormonautotropher Zellkulturen durch Transformation von O. basilicum, R. officinalis, S. fruticosa und S. officinalis mit Agrobacterium tumefaciens C58 Wildtyp beschrieben. Aufgrund der geringeren Gehalte sind diese jedoch im Vergleich zur hormonbasierten Zellsuspension von S. fruticosa für die Produktion von Triterpensäuren weniger geeignet.

Dieses Kapitel fasst die wesentlichen Ergebnisse der Arbeit abschnittsweise zusammen und gibt Vorschläge für anknüpfende Untersuchungen und offene Fragestellungen.