Konfokale Mikroskopie in Weiß

Um zu verstehen, was ein konfokales Mikroskop ist und welche Rolle die Farbe Weiß in der Mikroskopie spielt, sollen in den ersten zwei Kapiteln die Grundlagen zur Fluoreszenzmikroskopie besprochen werden. Hier wird zunächst eine kurze Einführung in die Wirkungsweise des klassischen Lichtmikroskops gegeben, darauf folgt die wichtige Diskussion um die Auflösung.

Die konfokale Mikroskopie wurde deshalb eine so erfolgreiche Technik, weil sie insbesondere in der Fluoreszenzmikroskopie eine ganz neue Dimension dem Beobachter zugänglich gemacht hat: nämlich die dritte Dimension. Darum soll hier das Phänomen der Fluoreszenz ausreichend Raum finden, da nicht nur die konfokale Mikroskopie, sondern auch die modernen Super‐Hochauflösungsverfahren auf dieser Erscheinung aufbauen.

Ein optisches Abbildungssystem, etwa ein Kameraobjektiv oder ein Mikroskop, zeigt scharf abgebildete Strukturen stets nur in einer begrenzten Tiefe. Davor und dahinter ist das Bild unscharf. Das trifft auch auf unser Auge zu, aber unser Gehirn hat raffinierte Verfahren entwickelt und nimmt die unscharfen Bildbestandteile einfach nicht wahr. Wir leiden also alle notorisch an selektiver Wahrnehmung. In der Mikroskopie ist der scharf abgebildete Bereich meist sehr klein, weil man für hohe Auflösungen Objektive mit großer Öffnung benutzen möchte – die Schärfentiefe verringert sich aber mit dem Quadrat der numerischen Apertur! Oft überstreicht deshalb der scharf abgebildete Bereich nur Bruchteile eines Mikrometers. Das widerspricht dem Wunsch des Biologen, möglichst zusammenhängende Strukturen zu untersuchen – am besten noch lebend. Sind die gefärbten Objekte in einem dicken Präparat sehr dicht, dann wird die scharf abgebildete Ebene völlig von unscharfen Schichten verdeckt: Man sieht vor lauter Wald die Bäume nicht mehr. Das konfokale Mikroskop schafft hier ganz vorzüglich Abhilfe, weil es auf optischem Wege nur die scharfe Schicht aus dem Unschärfe-Wald herausschneidet. Darum wird es gelegentlich auch als „Schichtschnittmikroskop“ oder „optisches Mikrotom“ bezeichnet.

Konfokale Mikroskopie wurde erst praktikabel, als eine Lichtquelle zur Verfügung stand, die es erlaubt, ausreichend Energie auf einen sehr kleinen Fleck zu konzentrieren. Mit der Erfindung des Lasers war eine solche Quelle plötzlich greifbar. Darum spricht man statt von konfokalen Mikroskopen auch gewöhnlich von „Laserscanning-Mikroskopen“, obwohl sich die Photonen aus einem Laser für die fluoreszierenden Moleküle natürlich auch nicht anders „anfühlen“ als Licht aus einer beliebigen anderen Quelle. Warum ein Laser mit einer Leistung von wenigen Milliwatt so viel besser geeignet ist, als etwa eine Bogenlampe mit 5 Watt Lichtleistung wird hier in einer kurzen Einführung in das Funktionsprinzip der Laser dargelegt.

Zur Auswahl eines oder mehrerer Anregungsfarbbänder bzw. -laserlinien war die klassische Lösung, ein Sortiment verschiedenster Pass- und Bandfilter vorrätig zu halten und bei Bedarf den passenden Filter mechanisch in den Strahlengang einzuschwenken. Um die Intensität einstellen zu können, waren verschiedene Graufilter mit unterschiedlicher Transmission nötig. Die sich daraus ergebende komplexe servomechanische Anordnung ist nicht sehr flexibel, wenig effizient, störanfällig und aufwendig. Bis alle Laserstrahlen vereinigt sind, muss jeder Strahl mit drei bis vier plan-optischen Elementen interagieren. Das Licht muss die Filter entweder durchstrahlen, oder es wird an einer Oberfläche reflektiert. Jede dieser Interaktionen vergrößert die Gefahr für Winkelfehler und Strahlversatz. Um dies zu vermeiden, muss ein großer Aufwand bei der mechanischen Stabilisierung und für die Justage getrieben werden. Es war darum eine große Erleichterung, als akustooptische Elemente für das sichtbare Spektrum zur Verfügung standen. Im diesem Kapitel wird Licht in die Geheimnisse der akustooptischen Filter gebracht, es wird erläutert, wie solche Geräte funktionieren und was man damit in Strahlrastermikroskopen machen kann. Zunächst betrachten wir die Auswahl der Farben zur Beleuchtung. Eine weitere geniale Anwendung wird dann im nachfolgenden Kapitel beschrieben.

Wir haben jetzt einen weißen Laser, aus dem sich mittels des akustooptischen durchstimmbaren Filters beliebige Farbbändchen und deren Kombinationen auswählen lassen. Im sichtbaren Bereich kann man auf diese Weise etwa 200 „Linien“ auswählen. Bei gleichzeitig acht solcher Linien aus 200 möglichen ergeben sich daraus rein theoretisch einige Trillionen verschiedene Farbkombinationen zur Anregung. An Flexibilität lässt das Verfahren also keine Wünsche offen. So weit, so gut. Spätestens bei der nächsten Stufe tauchen aber Fragezeichen auf: Wie kann man diese Vielfalt über sinnvolle Strahlteiler in den Auflicht-Beleuchtungsstrahl einkoppeln? Und wie kann man diese Einkoppelung gestalten, damit sie der Wellenlänge folgt, wenn man die Lichtquelle kontinuierlich in ihrer Farbe ändert? Eine geniale Lösung besticht oft durch kompakten Aufbau und Eleganz. So ist es mit dem akustooptischen Strahlteiler (AOBS, acousto optical beam splitter). Akustooptische Elemente können so beschaltet werden kann, dass bei farbiger Beleuchtung auf der Eingangsseite nur ausgewählte Farben in der 1. Ordnung austreten, alle anderen Farben findet man in der 0. Ordnung Nun muss man dieses Gerät „nur“ verkehrt herum betreiben, und schon hat man das gewünschte Ergebnis: ein Lichtventil, das kontinuierlich auswählbare Wellenlängen auf die Probe dirigiert, alle anderen Wellenlängen aber zum Nachweis auf den Detektor führt.

Sollen gleichzeitig mehrere Farbkanäle getrennt aufgezeichnet werden, muß eine räumliche Aufteilung von Segmenten des Farbspektrums erreicht werden. Dabei möchte man die Segmentgrenzen beliebig verschieben, ohne unerträglich viele Bauelemente einsetzen zu müssen. Räumliche Auffächerungen von Farben, also „Verteilungen“ sind naturgemäß das Ergebnis dispersiver optischer Elemente (lat. dispergere: zerstreuen, aufteilen). Solche dispersiven Elemente sind optische Gitter und optische Prismen. Beide erzeugen aus weißem Licht ein Farbspektrum, und beide werden inzwischen in spektralen Konfokalmikroskopen eingesetzt. Hier werden für beide Möglichkeiten die Funktionsweisen und Vor- und Nachteile beschrieben.

Ein Strahlteiler zerteilt den gesamten Lichtfluss in einzelne, separate Anteile, die dann auch für sich weiter bearbeitet werden können. Ein dispersives Element gibt den verschiedenen Farben zwar unterschiedliche Richtungen, aber das Licht ist immer noch in einem zusammenhängenden Spektrum verbunden. Um die einzelnen Anteile zu extrahieren, muss das gesamte Spektrum nach der Dispersion noch unterteilt werden. Dazu gibt es prinzipiell zwei Möglichkeiten: Zum einen kann man eine Serie von Sensoren in einer Reihe anordnen und auf diese Reihe das Spektrum abbilden. Andererseits lässt sich aber auch ein Detektorsystem mit variablen Segmenten aufbauen, und tatsächlich war der Multiband-Fluoreszenzdetektor auch das erste Verfahren zur spektralen Bildaufnahme in der konfokalen Mikroskopie. Daneben hat dieses Element noch die Aufgabe, letztmalig Hand an die Trennung der Fluoreszenzemissionen zu legen. Bei einem Zeilendetektor ist das nur rechnerisch möglich, da die Kanäle eines solchen Detektors nur gleichmäßig aufgeteilte Emissionen darstellen und nicht die einzelnen Fluoreszenzfarbstoffe getrennt werden können. Ein Multibanddetektor lässt sich hingegen physikalisch weiter so modifizieren, dass das Ergebnis sofort einzelne Fluoreszenzemissionen wiedergibt. Freilich kann man dann bei Bedarf noch beliebige Algorithmen auf die solcherart gemessenen Signale anwenden. Eine bestmögliche Trennung am Eingang dieser Algorithmen ist aber immer die bessere Ausgangssituation.

Bisher haben wir der Fluoreszenz-Lebensdauer wenig Beachtung geschenkt. Da sich die Lebensdauer des angeregten Zustandes im Bereich weniger Nanosekunden bewegt, ist sie nur mit schneller Elektronik zu fassen und war deshalb lange Zeit kein Standardparameter zur Messung von Phänomenen, die mit Fluoreszenz gekoppelt sind. In den letzten 20 Jahren hat sich dies geändert, und Messungen in Verbindung mit der Fluoreszenz-Lebenszeit sind immer häufiger in der Literatur anzutreffen. In diesem Kapitel wird über einfache Lebenszeitmessungen berichtet und darüber, wie man in der Fluoreszenzmikroskopie auch im Alltag aus diesen Zusammenhängen einen Nutzen ziehen kann. Ein auf der Lebensdauer begründetes Verfahren ist die „Lichtpforte“ (Light-Gate), mit der man einen weißen Filter erzeugen kann. Warum das kein physikalischer Kalauer ist, erfahren Sie in diesem letzten Kapitel.