Betrachtung mikrobieller Veränderungen in österreichischen Uferfiltraten mittels High-Throughput-Sequencing und Durchflusszytometrie

Grundwasser stellt die wichtigste natürliche Ressource von Trinkwasser weltweit dar. Aufgrund natürlicher Filtrationsprozesse durch die Erdoberfläche wird das Wasser gereinigt, gleichzeitig werden Nährstoffe durch verschiedenste Mikroorganismen um- und abgebaut, sodass ein oligotrophes Wasser entsteht (Bannick et al. 2008). Die sich im Wasser befindenden Mikroorganismen stellen gemeinsam ein stabiles Ökosystem dar, welches auf das geringe Nährstoffvorkommen sowie die abiotischen Umstände angepasst ist. Sie bilden eine autochthone Gemeinschaft (Karczewski et al. 2017). Dabei ist die Anzahl der Mikroorganismen im Grundwasser im Vergleich zu denen im Oberflächenwasser ca. um den Faktor zehn bis 100 geringer (Pedersen 2000).

Die große Mehrheit (über 99,9 %) der Mikroorganismen im Grundwasser ist zwar lebensfähig, aber nicht kultivierbar. Sie werden mit herkömmlichen kultivierungsbasierten Verfahren, die auch für die Beurteilung der mikrobiellen Trinkwasserqualität herangezogen werden nicht erfasst (Raes und Bork 2008). Inzwischen ist es anhand molekularbiologischer Methoden möglich, die Gesamtheit aller Mikroorganismen eines Ökosystems (das Mikrobiom) zu erfassen. Im Rahmen des High-Throughput-Sequencing werden Mikroorganismen aufgeschlossen und ein für taxonomische Untersuchungen geeigneter Abschnitt der DNA (16S-rRNA) extrahiert, vervielfältigt und die Nukleotid-Abfolge bestimmt. Für jede Probe werden auf diese Weise mehrere zehntausende 16S-Abschnitte (Reads) sequenziert. Nach bioinformatischer Aufbereitung leitet sich daraus die mikrobielle Zusammensetzung der Probe in Form von Anteilen (relative Abundanzen) einzigartiger Amplicon-Sequenzvarianten (ASV) ab. Nach einem Datenbankabgleich mit bekannten Sequenzen kann eine taxonomische Zuordnung erfolgen. Mit dieser Methode können zwar keine phänotypischen, metabolischen Charakteristika direkt bestimmt werden, jedoch erlauben vergleichende Analysen verschiedener Proben Rückschlüsse auf die Auswirkungen bestimmter Faktoren auf die mikrobiellen Gemeinschaften (Hou et al. 2018).

Der Prozess der natürlichen Filtration wird bei der Gewinnung von Uferfiltraten angewendet: Durch ufernahe Grundwasserförderung wird eine Potenzialdifferenz der Wasserstände zwischen Oberflächen- und Grundwasser geschaffen, wodurch Oberflächenwasser durch den Untergrund fließt und dabei filtriert wird. Grundwasser wird mit diesem Uferfiltrat angereichert. Die im Oberflächenwasser vorhandenen Mikroorganismen werden während der Passage teilweise filtriert und aufgehalten, teilweise gelangen sie als allochthone (gebietsfremde) Mikroorganismen in das Grundwasser und verändern dadurch die mikrobielle Gemeinschaft (Hiscock und Grischek 2002). Der Anteil des Uferfiltrats am Grundwasser bestimmt dabei maßgeblich die Veränderung der mikrobiellen Gemeinschaften, d. h. den allochthonen Einfluss. Das bedeutet, dass sich bei einer hohen Potenzialdifferenz zwischen Grundwasser und Flusspegel – bewirkt etwa durch hohe Niederschläge einerseits oder große Fördermengen andererseits – der Anteil der mikrobiellen Gemeinschaft aus dem Uferfiltrat erhöht. Gleichzeitig verringert sich die Dauer der Untergrundpassage und damit die Filtrationsleistung, wodurch der Effekt des allochthonen Einflusses verstärkt wird (Grombach et al. 2000).

Vergleichende Analysen mikrobieller Zusammensetzungen verschiedener Uferfiltrate können Hinweise auf den Grad der Oberflächenbeeinflussung liefern und erlauben so Rückschlüsse auf Verteilungsmuster, auf die Dauer der Beeinflussung und Erholung von allochthonen Einträgen. Das Vorhandensein bzw. die Abwesenheit bestimmter Bakteriengruppen kann Hinweise auf die hygienische Qualität und auch auf möglicherweise auftretende technische Probleme liefern. Die Kombination von molekularbiologischen Ansätzen mit robusten quantitativen Methoden zur Bestimmung der Gesamtkonzentration an Zellen vertieft das mikrobiologische Bild beträchtlich. Hier kann die Durchflusszytometrie aufgrund ihrer schnellen und unkomplizierten Untersuchungsmethode sowie der hohen Durchsatzraten und der Möglichkeit zur Online-Messung auch kurzzeitige Veränderungen in der Zellzahl feststellen und so einen Hinweis auf mikrobielle Veränderungen liefern (van Nevel et al. 2017).

Um einen Überblick über räumliche und zeitliche Veränderungen und Abhängigkeiten des Mikrobioms in verschiedenen Uferfiltraten in Österreich zu erhalten, wurden entlang der Donau sechs Uferfiltratstandorte mit insgesamt 18 Brunnen untersucht (Abb. 1). Dabei zeigt sich insgesamt eine räumliche Trennung der sechs Standorte, insbesondere die Standorte B und F sind klar von den übrigen abzugrenzen (Abb. 3). Die räumliche Nähe der Brunnenfelder C und D zueinander sowie standortspezifische Eigenheiten (relativ nahe Positionierung an der Donau) können hier als Erklärung für deren Ähnlichkeit dienen. Brunnenfeld A befindet sich in deutlicher Entfernung von den anderen Standorten, unterscheidet sich insgesamt aber nicht in besonderem Ausmaß von den anderen. Je nach Standort können auch sehr kleinräumige hydrogeologische Unterschiede Bedeutung gewinnen, wie etwa im Brunnenfeld F ersichtlich, wo die Abstände zwischen den Brunnen nur etwa 50 m betragen (Abb. 12). Hier lassen sich die Brunnen 1 bis 3 gut von den Brunnen 4 bis 6 abgrenzen (Abb. 11). Darüber hinaus weist Brunnen 5, der am weitesten vom Oberflächengewässer entfernt ist, eine deutlich unterschiedliche chemische Zusammensetzung auf. Wenngleich sich diese chemische Unterschiedlichkeit nicht in der mikrobiologischen Zusammensetzung widerspiegelt, so ist hier die Beeinflussung durch das Oberflächenwasser (den Altarm) für diesen Brunnen wohl am geringsten. Die Dauer der Bodenpassage nimmt großen Einfluss auf die Zusammensetzung der Mikroorganismen.

Im jahreszeitlichen Verlauf zeigen sich weniger starke Unterschiede in der Zusammensetzung der Mikrobiome, wenngleich sich eine zeitliche Gruppierung zumindest andeutet (Abb. 5). Durch den Temperaturgang und andere abiotische Faktoren, die sich saisonal verändern, können bestimmte Bakteriengruppen in ihrem Wachstum beeinflusst werden. Mit der Donau besteht auch eine Gemeinsamkeit, die gleichartiges zeitliches Verhalten über verschiedene Standorte hinweg erklärbar macht. Eine Zunahme der relativen Anteile der Verrucomicrobiota an den Standorten B und E vom Frühjahr bis Herbst 2016 ist auffallend (Abb. 7). Letztere gehören zu den typischen Süßwasserbakterien (Newton et al. 2011) und können auf einen verstärkten Eintrag aus dem Oberflächenwasser hindeuten, möglicherweise verursacht durch einen saisonal geänderten hydraulischen Gradienten zwischen Brunnen und Oberflächenwasser.

Innerhalb der sechs Brunnen des Brunnenfeldes F, die bereits ausführlich in Fiedler et al. (2018) untersucht wurden, wird ein allochthoner Einfluss auf das autochthone Grundwassermikrobiom sehr deutlich (vergleiche auch Danielopol et al. 2003 und Griebler und Lueders 2009). Die Tatsache, dass der Anteil jener Sequenzvarianten, die auch in der Donau vorkommen, bei erhöhtem Wasserstand des Oberflächengewässers stark ansteigt, zeigt recht klar, dass die Veränderung wohl durch allochthonen Eintrag aus dem Altarm entsteht. Auch die Zunahme der Phyla Cyanobacteria, Actinobacteriota und Bacteroidota, die allesamt typischerweise in Oberflächengewässern auftreten (Iliev et al. 2017; Kim et al. 2018; Newton et al. 2011) deutet in diese Richtung. Es ist weniger plausibel, dass hier eine bloße Änderung der Umgebungsbedingungen im Untergrund die Ursache ist. Die chemisch-physikalischen Parameter deuten auch nicht auf einen dramatischen Wechsel hin. Das Ausbleiben einer deutlichen Änderung dieser Parameter, etwa der Temperatur oder der Leitfähigkeit, bei vermutetem Oberflächenwassereinfluss mag auf eine jahreszeitlich bedingte Ähnlichkeit zwischen Grund- und Oberflächenwasser zurückzuführen sein. Die bei erhöhtem Wasserstand zu verzeichnende deutliche Zunahme der Gesamtzellzahl kann ebenso mit einem allochthonen Eintrag erklärt werden. Auch wenn der Anteil an Oberflächenwasser nur gering sein sollte, ist durch die wesentlich höhere Zelldichte im Oberflächengewässer eine stärkere Beeinflussung des mikrobiologischen Zustandes rasch erreicht.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass mit der Bestimmung der taxonomischen Zusammensetzung (Mikrobiom) durch das High-Throughput-Sequencing ein äußerst sensitives Werkzeug zur Beschreibung des mikrobiologischen Zustands von Wasserproben zur Verfügung steht. Wie dargelegt wurde, ist es möglich, die Resultate von zeitlich deutlich auseinanderliegenden Untersuchungen sinnvoll zu vergleichen und daraus neue Erkenntnisse zu gewinnen. Hier konnte etwa ein sehr starkes Indiz für den direkten (mikrobiologischen) Einfluss von Oberflächenwasser in die Gewinnungsstellen gewonnen werden. Ein Schwerpunkt dieser Arbeit bestand hauptsächlich in der (bloßen) Betrachtung von Ähnlichkeiten zwischen Proben mittels bioinformatischer Hilfsmittel. Damit verbleibt insbesondere die ökologische Interpretation, die sich mit den Funktionen der mikrobiologischen Gemeinschaft beschäftigt, als zukünftige Herausforderung.